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定義
實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ分析儀是一種將傳統(tǒng)ＰＣＲ擴(kuò)增與熒光信號(hào)檢測(cè)同步進(jìn)行的高精度分子生物學(xué)設(shè)備。通過(guò)在ＰＣＲ反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物（探針或染料），實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）的定量（絕對(duì)／相對(duì)）或定性分析，無(wú)需后期電泳檢測(cè)。
核心原理
ＰＣＲ擴(kuò)增基礎(chǔ)
遵循聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）三步驟：變性（高溫解鏈ＤＮＡ）、退火（引物結(jié)合模板）、延伸（合成新鏈）。
熒光信號(hào)生成
ＴａｑＭａｎ探針：５＇端報(bào)告基團(tuán)（ＦＡＭ），３＇端淬滅基團(tuán)（ＴＡＭＲＡ），水解后釋放熒光。
分子信標(biāo)：莖環(huán)結(jié)構(gòu)，結(jié)合靶序列后發(fā)夾打開(kāi)，熒光恢復(fù)。
雙雜交探針：相鄰探針發(fā)生ＦＲＥＴ能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生熒光。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等染料嵌入雙鏈ＤＮＡ，發(fā)射熒光（強(qiáng)度與產(chǎn)物量成正比）。
缺點(diǎn)：易受非特異產(chǎn)物干擾。
熒光染料法（非特異性）：
熒光探針?lè)ǎㄌ禺愋裕?/p>
實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)
每輪循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，生成擴(kuò)增曲線。
閾值線（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：背景熒光以上的設(shè)定值，與Ｃｔ值相關(guān)。
Ｃｔ值（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，與起始模板量負(fù)相關(guān)（定量依據(jù)）。
核心組件
| 組件 | 功能 |
|---|---|
| 熱循環(huán)模塊 | 精確控制溫度（±０．１℃），實(shí)現(xiàn)變性、退火、延伸的快速切換。 |
| 光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng) | － 光源：ＬＥＤ、鹵鎢燈或激光器 － 濾光片／光柵：選擇激發(fā)／發(fā)射波長(zhǎng) － 檢測(cè)器：ＣＣＤ或ＰＭＴ捕獲熒光信號(hào) |
| 多通道檢測(cè) | 支持４－６色熒光通道（如ＦＡＭ， ＨＥＸ， ＲＯＸ， Ｃｙ５），實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。 |
| 溫控技術(shù) | － Ｐｅｌｔｉｅｒ半導(dǎo)體溫控：主流技術(shù) － 離心式空氣加熱（快速ＰＣＲ儀） |
| 軟件與分析模塊 | 控制儀器運(yùn)行，分析擴(kuò)增曲線、計(jì)算Ｃｔ值、生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、輸出定量／熔解曲線結(jié)果。 |
工作流程
樣本準(zhǔn)備：提取核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ），構(gòu)建反應(yīng)體系（引物、探針、酶、ｄＮＴＰｓ）。
加樣：轉(zhuǎn)移至專(zhuān)用ＰＣＲ管或９６／３８４孔板。
程序設(shè)置：
溫度程序（預(yù)變性→循環(huán)擴(kuò)增→延伸）
熒光通道選擇（根據(jù)染料／探針波長(zhǎng)）
實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：每輪循環(huán)結(jié)束采集熒光信號(hào)。
數(shù)據(jù)分析：
定量分析：通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算模板拷貝數(shù)（絕對(duì)定量）或相對(duì)表達(dá)量（如２＜ｓｕｐ＞?ΔΔＣｔ＜／ｓｕｐ＞法）。
定性分析：熔解曲線分析（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法驗(yàn)證產(chǎn)物特異性）。
陽(yáng)性判定：Ｃｔ值≤預(yù)設(shè)閾值（通常３５－４０）。
關(guān)鍵性能參數(shù)
| 參數(shù) | 意義 |
|---|---|
| 檢測(cè)靈敏度 | 最低可檢出模板量（可達(dá)單拷貝級(jí)別）。 |
| 動(dòng)態(tài)范圍 | 可準(zhǔn)確定量的濃度范圍（通常跨越６－８?jìng)€(gè)數(shù)量級(jí)）。 |
| 分辨率 | 區(qū)分濃度差異的能力（如±１．５倍差異）。 |
| 通量 | 單次運(yùn)行樣本數(shù)（９６孔／３８４孔板，高通量機(jī)型支持?jǐn)?shù)千樣本／天）。 |
| 升溫／降溫速率 | 影響ＰＣＲ速度（常規(guī)儀器：３－５°Ｃ／秒；快速ＰＣＲ儀：＞１０°Ｃ／秒）。 |
| 多色檢測(cè)能力 | 支持同步檢測(cè)的熒光通道數(shù)（４－６通道為主）。 |
主要應(yīng)用領(lǐng)域
病原體檢測(cè)
病毒（ＣＯＶＩＤ－１９、流感、ＨＩＶ）、細(xì)菌（結(jié)核分枝桿菌）、寄生蟲(chóng)的快速診斷。
基因表達(dá)分析
ｍＲＮＡ定量（ｑＲＴ－ＰＣＲ），研究基因調(diào)控機(jī)制。
基因分型與突變檢測(cè)
ＳＮＰ分析、插入／缺失鑒定（探針?lè)ɑ蛉劢馇€分析）。
轉(zhuǎn)基因檢測(cè)
食品／作物中轉(zhuǎn)基因成分定量（如３５Ｓ啟動(dòng)子、ＮＯＳ終止子）。
藥物開(kāi)發(fā)與藥效評(píng)估
靶基因表達(dá)水平監(jiān)測(cè)。
法醫(yī)學(xué)
ＤＮＡ指紋圖譜、親子鑒定。
優(yōu)勢(shì)與局限性
| 優(yōu)勢(shì) | 局限性 |
|---|---|
| ? 高靈敏度與特異性 | ? 易受抑制劑影響（血色素、肝素等） |
| ? 閉管操作，降低污染風(fēng)險(xiǎn) | ? 引物／探針設(shè)計(jì)難度高（尤其多重檢測(cè)） |
| ? 定量范圍廣，無(wú)需后期處理 | ? 設(shè)備及試劑成本較高 |
| ? 快速獲得結(jié)果（１－２小時(shí)） | ? 對(duì)實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范性要求嚴(yán)格 |
| ? 支持多重檢測(cè)（多靶標(biāo)同步分析） | ? 絕對(duì)定量需標(biāo)準(zhǔn)品（增加復(fù)雜性） |
使用注意事項(xiàng)
防污染措施：
分區(qū)域操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)）。
使用帶濾芯吸頭、ＵＶ燈消毒工作臺(tái)。
質(zhì)量控制：
設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)模板）、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)參基因（如ＧＡＰＤＨ）。
探針／染料選擇：
多重檢測(cè)需避免光譜重疊。
ＲＮＡ檢測(cè)：
需逆轉(zhuǎn)錄步驟（ｑＲＴ－ＰＣＲ），嚴(yán)防ＲＮＡ酶污染。
發(fā)展趨勢(shì)
便攜化與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)
手持式／床旁快速ＰＣＲ儀（如用于突發(fā)疫情現(xiàn)場(chǎng)篩查）。
自動(dòng)化整合
與核酸提取儀、液體處理工作站聯(lián)用，構(gòu)建全自動(dòng)檢測(cè)線。
數(shù)字ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）互補(bǔ)
提供絕對(duì)定量無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，適用于低豐度靶標(biāo)分析。
多重檢測(cè)能力提升
發(fā)展１０色以上熒光系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)超多重靶標(biāo)同步檢測(cè)。
ＡＩ輔助分析
自動(dòng)識(shí)別異常擴(kuò)增曲線，優(yōu)化結(jié)果判讀準(zhǔn)確性。
代表廠商與機(jī)型
賽默飛世爾（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５／７， ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ
伯樂(lè)（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）：ＣＦＸ９６／３８４， ＣＦＸ Ｏｐｕｓ
羅氏（Ｒｏｃｈｅ）：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０／９６
安捷倫（Ａｇｉｌｅｎｔ）：ＡｒｉａＭｘ
國(guó)產(chǎn)平臺(tái)：宏石（ＳＬＡＮ）、博日（ＬｉｎｅＧｅｎｅ）
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